Einführung:

Die Konfokale Laserscanmikroskopie ist eine nichtinvasive Methode zur hochauflösenden in vivo Diagnostik in Echtzeit von Hautveränderungen. Die Bildgebung erfolgt durch die Reflektion eines in unterschiedlichen Hautschichten fokussierten Laserstrahls. Die entstehenden Bilder in zellulärer Auflösung resultieren aus den unterschiedlichen Brechungsindizes verschiedener Hautstrukturen.

Die Deutsche Abkürzung für das Verfahren lautet KLSM, neuer auch KLM (konfokale Laserscanmikroskopie. In der englischen Literatur wird die Methode Reflectance Confocal Microscopy (RCM) genannt.

Eine aktuelle AWMF Leitlinie „Konfokale Lasermikroskopie in der Dermatologie“ existiert seit Juli 2011 [1].

Mit der Konfokalen Laserscanmikroskopie steht ein bildgebendes Verfahren zur Verfügung, welches die Haut in Horizontalschnitten zeigt und dabei eine Auflösung auf Zellniveau bietet. Die laterale Bildauflösung liegt mit 0,5-1,0µm auf zellulärem Niveau und die axiale Auflösung (Schichtdicke) liegt bei 3-5µm. Die Grundprinzipien der konfokalen Laserscanmikroskopie wurden bereits 1957 beschrieben, der erste Bericht über die Konfokalmikroskopie an der Haut erschien jedoch erst 1995.

Das als VivaScope (Fa. MAVIG GmbH) bekannte konfokale Laserscanmikroskop verwendet als monochromatische und kohärente Lichtquelle einen 830nm Diodenlaser. Der Laserstrahl penetriert die oberen Hautschichten und beleuchtet einen kleinen Bereich innerhalb des Gewebes. Das Licht wird reflektiert und durch eine sehr kleine Lochblende auf einen Detektor geleitet, wo ein hochaufgelöstes, scharfes Bild entsteht. Im Unterschied zur konventionellen Mikroskopie erzeugt nur das reflektierte Licht eines fokal mit dem Laser beleuchteten Herdes ein Bild. Daher resultiert die Bezeichnung „konfokal“. Reflektiertes Licht von außerhalb der Fokus-Ebene gelangt nicht durch die Nadelöhr-artige Öffnung zum Detektor.

Abb.1: Prof. Salvador Gonzalez leitete das 1. ICWG Welt-Symposium.

Die Kontrastgebung der KLSM-Bilder resultiert aus den unterschiedlichen Reflexionsgraden des Gewebes, abhängig von chemischen und molekularen Strukturen. Durch die Unterschiede im Brechungsindex wird jeweils nur eine bestimmte Menge an Licht reflektiert. Strukturen mit einem hohen Brechungsindex erscheinen konfokalmikroskopisch hell. Melanin und Melanosomen stellen die intensivsten natürlichen Kontrastquellen dar, die im KLSM-Bild weiß abgebildet werden. Andere stark reflektierende Strukturen sind Keratin und Kollagen. Das im klinischen Einsatz derzeit am häufigsten verwendete VivaScope 1500 benutzt einen Diodenlaser mit einer kurzwelligen Infrarot-Wellenlänge von 830nm. Die eingesetzte Laserenergie von weniger als 30mW verursacht keinerlei Gewebeschädigung, ist aber auf eine Gewebeeindringtiefe von 200-300 µm limitiert. Dies entspricht in vielen anatomischen Regionen der Lokalisation der oberen retikulären Dermis.

Die Untersuchung ist für den Patienten schmerzfrei. Das untersuchte Hautareal bleibt verletzungsfrei intakt, wodurch das Auftreten möglicher Artefakte bei dieser (vital-) histologischen, nichtinvasiven Echtzeit-Untersuchung lebenden Gewebes minimiert wird. Somit ist auch die Möglichkeit einer Verlaufsbeobachtung bei dynamischen Prozessen gegeben.

Im Unterschied zur klassischen Histologie, bei der Vertikalschnitte begutachtet werden, erfolgt die vitalhistologische Untersuchung mit dem Konfokalmikroskop in der Horizontalebene, so dass je nach Größe der Läsion ein kompletter Querschnitt über die ganze Fläche z. B. eines Naevus innerhalb einer Schicht angeschaut werden kann. Die beim rasterartigen Abfahren der Läsion gewonnenen Einzelbilder haben eine Größe von je 500µm x 500µm. Diese werden durch die VivaScope-Software zu einem Querschnitt-Mosaik („VivaBlock“) von derzeit bis zu 8mm x 8mm Fläche zusammengesetzt. Diese Querschnitte können je nach Interessenlage aus unterschiedlichen Gewebeschichten wie z.B. dem Stratum corneum, Stratum granulosum, Stratum spinosum, der dermoepidermalen Junktionszone, der papillären Dermis oder der oberen retikulären Dermis gewonnen werden. In der Regel werden vertikale Abstände zwischen den Schichten von 20µm-30µm, z.B. je nach Hautdicke der „region of interest“ gewählt [2-9]. Aus im vertikalen Verlauf besonders interessanten Arealen kann auch eine optische Stanzbiopsie, genannt VivaStack, genommen werden. Hierbei wird ein 0,5mm x 0,5mm kleines Areal in Abständen von beispielsweise 1,5µm oder 3µm bis zu einer Eindringtiefe von 150-300µm sequentiell verfolgt. Daneben können auch noch Filmsequenzen aufgenommen werden, bspw. vom Blutfluss.

Aktuelle Entwicklungen und Einsatzgebiete:

Für die Konfokale Laserscanmikroskopie gibt es zahlreiche Einsatzgebiete, die sich mit der klassischen Histologie überschneiden, wie die Diagnostik verschiedener Hautkrebstypen oder auch die Differentialdiagnose inflammatorischer Hautkrankheiten. Durch die Möglichkeit der schmerzfreien in vivo Diagnostik auf Zellniveau haben sich aber bereits zahlreiche zusätzliche Indikationen ergeben, für die kein invasiver Eingriff notwendig oder gewünscht ist: Differenzierung kutaner Fremdkörper [10], die definitive Abheilungskontrolle von Viruswarzen [11], die präoperative Schnittranddetermination bei der Exzision von Basalzellkarzinomen oder relativ neu noch das therapeutische Monitoring ästhetischer Lasertherapien [12].

Eine sehr gute Übersicht über die aktuellen Entwicklungen und Einsatzgebiete der Konfokalen Laserscanmikroskopie konnte man auf dem Welt-Symposium der International Confocal Working Group gewinnen, welches unter der Leitung von Prof. Salvador Gonzalez (Madrid, New York) (Abb.1) im Juni 2016 in Madrid stattfand.

Die International Confocal Working Group ist eine Gruppe von Medizinern und Forschern der die Anwendung und Weiterentwicklung der bildgebenden dermatologischen Diagnostik mit der Konfokalen Laserscanmikroskopie (Reflectance Confocal Microscopy (RCM)) am Herzen liegt. In gemeinschaftlicher Arbeit wird die Ausbildung zur Beherrschung der Methode gefördert, werden Kriterien für die Beurteilung von Läsionen in Studien erforscht und festgelegt und die diagnostische Genauigkeit immer weiter verbessert.

Abb. 2a: Akantholytische Zellen beim Pemphigus der Kopfhaut in der KLSM, Quelle Vortrag Francesco Lacarrubba.

Abb. 2b: Akantholytische Zellen beim Pemphigus im direkten Vergleich zwischen Histologie und VivaScope-Aufnahme, Quelle Vortrag Francesco Lacarrubba.

Ziele sind u.a. das therapeutische Monitoring von Dermatosen, die Vermeidung unnötiger Exzisionen von Naevi und anderen Hautveränderungen sowie die weitere Erhöhung der Sensitivität bei der Melanom-Früherkennung.

Die Kongressinhalte bildeten einen Rundumschlag durch alle dermatologischen Bereiche, in denen die Konfokale Laserscanmikroskopie sinnvoll und bereichernd eingesetzt werden kann.

Abb. 3: Zahlreiche Demodex Milben in einem Follikel der Wangenhaut. Quelle: Praxis Dr. Dorittke und Dr. Kardorff Mönchengladbach.

Den Auftakt machte Marco Ardigo aus Rom / Italien mit dem State of the Art der KLSM / RCM bei entzündlichen Hauterkrankungen. Insbesondere laufen aktuelle Studien zur Akne, Rosacea, Kopfhauterkrankungen, Melasma und Vitiligo. Besonders vielversprechend sind hierbei die objektivierbaren, nicht-invasiven Therapieverlaufskontrollen auf Zellniveau.

Marina Agozzino (Rom/ Italien) berichtete über den Nutzen der Konfokalen Laserscanmikroskopie im Bereich der Trichologie und Trichoskopie. Durch Anwendung der KLSM erhält man sehr präzise Informationen über die Verteilung und Dichte adnexaler Strukturen, die Konsistenz der Haarschäfte und die Lokalisation und Menge inflammatorischer Zellen in den unterschiedlichen Hautschichten. Weiterhin ist die RCM sehr gut geeignet, narbenbildende von nicht-narbenbildenden Alopezien zu differenzieren. Auch das Stadium der narbenbildenden Alopezien ist gut einzuschätzen am lebenden Gewebe durch die Zahl der Entzündungszellen und den unterschiedlichen Grad dermaler Sklerosierung entlang der Adnexe. Somit ist die KLSM ideal für die Begleitung und Evaluation therapeutischer Prozesse.

Das Thema von Francesco Lacarrubba (Catania / Italien) war die in vivo Mikroskopie blasenbildender Erkrankungen. Hierbei kann man mit der KLSM sowohl die Vesikel leicht identifizieren, wie auch die Split-Ebene klar definieren. Es gibt eine ausgezeichnete Korrelation zwischen den konfokalmikroskopischen Bildern, dem Tzanck Test und der Histopathologie (Abb. 2a, 2b). Die KLSM unterstützt die klinische Diagnosestellung der blasenbildende Dermatose und gibt Hinweise für weitere notwendige Untersuchungen. Mit dem Handmikroskop, dem sogenannten VivaScope 3000, ist eine schnelle Untersuchung verschiedener Lokalisationen möglich. Insbesondere anatomisch schwierige Stellen wie Hautfalten, Kopfhaut, Nasenwinkel, Augenlider, Schleimhaut und Ohren sind für das Handgerät leicht zugänglich.

Hochinteressant sind die konfokalmikroskopischen Optionen zur Beobachtung der Hautalterung. Wie man im Live-Bild sieht, ist junge Haut durch regulär angeordnete polygonale Keratinozyten und fein definierte, netztartig angeordnete Kollagenfasern definiert. Mit zunehmendem Alter, so die Referentin aus dem wissenschaftlichen Beirat der ICWG, Caterina Longo (u.a. Modena / Italien), sind die Keratinozyten unregelmäßiger geformt, Areale unregelmäßiger Pigmentierung zeigen sich und die Kollagenfasern werden kompakter. Dies alles lässt sich hervorragend mit der Konfokalmikroskopie der Haut reproduzierbar und eindrucksvoll nachvollziehen. Beim älteren Menschen wird die leicht zu messende Dicke der Epidermis immer geringer, die Keratinozytenatypien werden augenfälliger und ein Wirrwarr von Kollagenbündeln und gekräuselten Fasern beweisen die zunehmende Elastosis cutis.

Elke Sattler (LMU München) zeigte ihre eindrucksvollen Untersuchungsergebnisse zum therapeutischen Monitoring bei Rosacea. Durch die KLSM können z.B. Demodex-Milben (Abb. 3) nichtinvasiv und in vivo einfach entdeckt und in ihrer Quantität bestimmt werden. Die Milbenzahl der Haut bei Rosacea Patienten ist bei weitem höher als in gesunder Gesichtshaut. Durch die Lasermikroskopie kann die Milbenzahl an gleicher, reproduzierbarer Lokalisation einfach und eindeutig bestimmt werden und ohne Entfernung der Milben, z.B. durch umständliches Tesa-Stripping und händisches Mikroskopieren, im Therapieverlauf überwacht werden. Hierdurch sieht man den eindeutigen therapeutischen Effekt durch z.B. systemisches Doxycyclin oder topisches Ivermectin an der selben Vergleichsstelle, ohne dass man die Milbenreduktion auf die mechanische Entfernung bei herkömmlichen Untersuchungsmethoden zurückführen kann.

Die vivaskopischen Möglichkeiten der Subtypisierung der Psoriasis und der Überwachung des Therapieverlaufs präsentierte Anna Pampin (Madrid / Spanien). Z.B. kann die Plaque-Psoriasis von der Guttata-Form differenziert werden, sowie können Unterschiede zwischen stabilen und instabilen Psoriasisplaques dargestellt werden. Im Gegensatz zur klassischen Histologie können biologische Veränderungen unter der antipsoriatischen Therapie an exakt der selben Lokalisation beobachtet werden.

Dies ist sowieso die große diagnostische Überlegenheit der Konfokalen Laserscanmikroskopie bei allen nichtinvasiven Therapieformen. Bei der konventionellen Dermatohistopathologischen Untersuchung wird prinzipiell das zu untersuchende Gewebestück entfernt. Somit muss eine Verlaufsbiopsie zwangsläufig von einer anderen Stelle entnommen werden. Der ideale Verlaufsbeobachtungszustand ist jedoch prinzipiell das Monitoring ein und derselben Stelle. Wie die Zusammenfassung der Vorträge durch Prof. Salvador Gonzalez (Abb. 1) zeigte, bietet die KLSM ideale Monitoringeigenschaften bei inflammatorischen Hauterkrankungen, blasenbildenden Dermatosen, beim weißen Hautkrebs (NMSC), bei Haarerkrankungen, u.v.m.

Auch Martina Ulrich (Berlin), die Deutsche Konfokal-.Spezialistin insbesondere für den nichtmelanozytären Hautkrebs brachte eindrucksvolle Beispiele und Untersuchungen zu Aktinischen Keratosen sowie in situ und invasiven Plattenzellkarzinomen (Abb.4).

Viele weitere Kongresshighlights boten Alon Scope (Israel) zur Naevus Diagnostik, Susana Puig (Barcelona) und Caterina Longo (Italien) zum Melanom und die Dermatohistopathologin Melissa Gill (NY, USA) mit ihren spektakulären Vergleichsbildern zwischen den schwarz-weißen RCM-Bildern und der klassischen Histologie. Sie zeigte gerade im Bereich des melanozytären Hautkrebs das besondere Früherkennungspotential der Konfokalmikroskopie anhand der optischen horizontalen Schnittführung auf und präsentierte vergleichend, welche histologischen Schnittebenen man benötigen würde, um direkt vergleichbar zur KLSM die histologischen Zellveränderungen zu sehen.

Einen großen Schwerpunktblock stellte aber auch die in internationalen Kliniken praktizierte ex vivo Konfokalmikroskopie mit dem VivaScope dar, die z.B. intraoperativ als alternative, rasche und unkomplizierte Schnellschnittdiagnostik eingesetzt wird. Neben Referenten aus Spanien, Italien und den USA referierten Daniela Hartmann (München) und Frau Prof. Julia Welzel (Augsburg) zu diesem innovativen Themenkomplex. Prof. Welzel gab konkrete Hinweise und zeigte einige Tricks zur optimalen Bilddarstellung und Auflösung bei der Ex Vivo KLSM.

Stand in Deutschland, Ausblick und Ausbildung:

Zahlreiche Studien zu aktinischen Keratosen, Basalzellkarzinomen und melanozytären Tumoren haben eine hohe Spezifität und Sensitivität für das bildgebende dermatologisch-diagnostische Verfahren der Konfokalen Laserscanmikroskopie gezeigt. Eine aktuelle AWMF Leitlinie „Konfokale Lasermikroskopie in der Dermatologie“ existiert seit Juli 2011 [1]. Ein unschätzbar hoher Nutzen entsteht im Praxisalltag für Arzt und Patient/in durch die unblutige, histologische Einschätzung melanozytärer Läsionen hinsichtlich ihrer Dignität, um eine Melanomfrüherkennung zu ermöglichen, aber auch um unnötige Exzisionen zu vermeiden. Eine ausgezeichnete Option besteht im non-invasiven Monitoring ästhetischer und kosmetologischer Therapien, wie z.B. Lasertherapien [12].

Abb. 4: Martina Ulrich aus Berlin beim Vortrag über die bildgebende Diagnostik mittels KLSM beim nicht-melanozytären Hautkrebs.

Im Vergleich zu anderen europäischen Ländern wie Italien, Spanien oder auch Frankreich, wird diese bildgebende, hochauflösende dermatologische in vivo Diagnostik auf Zellniveau in Deutschland noch relative stiefmütterlich behandelt. Inzwischen gibt es zwar ca. 35 ambulante Zentren in Hautarztpraxen deutschlandweit, die u.a. zur Früherkennung von Melanomen oder zur Verlaufsbeobachtung von Dermatosen die Konfokale Laserscanmikroskopie einsetzen. Unerklärlicherweise scheint jedoch bislang unsere universitäre Medizin bei der fortschrittlichen Entwicklung der nichtinvasiven, bildgebenden Diagnostik auf Zellniveau hinterher zu hinken. Rühmliche Ausnahmen mit hoher internationaler Anerkennung und Akzeptanz im Bereich der konfokalen Laserdiagnostik stellen dabei unter anderem die Zentren der LMU München, Berlin und Augsburg dar.

Wer nicht den Anschluss an die diagnostische, non invasive Zukunft der bildgebenden Verfahren in der Dermatologie verpassen möchte kann an ausgefeilten Schulungen teilnehmen, die von den Experten und Pionieren der Methode in Italien und Deutschland durchgeführt werden. Außerdem existieren bislang zwei hervorragende Lehrbücher mit Bildatlanten [4,8], ein „Kurzlehrbuch“ in Deutscher Sprache [2] sowie ein ausgesprochen lehrreiches Online-Training über 10 Wochen. Weitere Informationen und ständige Fortbildungsangebote gibt es u.a. über den derzeit im Wechsel in Berlin und Köln tagenden Deutschen „Qualitätszirkel für Konfokale Laserscanmikroskopie in der Dermatologie“, über die „International Confocal Working Group (ICWG )“ sowie über die „Arbeitsgemeinschaft für physikalische Diagnostik in der Dermatologie (ApDD)“ der Deutschen Dermatologischen Gesellschaft (DDG).